三代測序
三代測序簡介
【添加時間：2016-09-05 09:17:49】【來源：】【作者：dggadmin】
第三代測序技術是指單分子測序技術。測序不需要經過PCR擴增，實現了對每一條DNA分子的單獨測序。主要代表為美國Pacific Bioscience公司的SMRT技術。脫氧核苷酸用熒光標記，顯微鏡可以實時記錄熒光的強度變化。當熒光標記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候，其熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形成化學鍵的時候，其熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。最新推出的Sequel單分子測序平臺保留了PacBio RS II長讀取、均一覆蓋和甲基化信息的優勢，其測序通量是后者的7倍。
第三代測序的技術特點是：
圖1：PacBio RS II 測序儀
圖2：PacBio Sequel測序儀
圖3： SMRT技術建庫流程
第三代測序的技術特點是：
1、實現了DNA聚合酶內在自身的反應速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學法測序的2萬倍。
2、實現了DNA聚合酶內在自身的延續性，一個反應就可以測非常長的序列（可以測幾千個堿基）。
3、精度非常高，達到99.9999%。
4、直接測RNA的序列。以RNA為模板復制DNA的逆轉錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉錄產生的系統誤差。
5、第二個是直接測甲基化的DNA序列。DNA聚合酶復制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不同。根據這個不同的時間，可以判斷模板的C是否甲基化。
第三代測序的應用主要有三個方面：
1. 基因組測序
第三代測序的應用主要有三個方面：
1. 基因組測序
由于具有讀長長的特點，SMRT測序平臺在基因組測序中能降低測序后的Contig數量，明顯減少后續的基因組拼接和注釋的工作量，節省大量的時間。
2. 甲基化研究
SMRT技術采用的是對DNA聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法，聚合酶合成每一個堿基，都有一個時間段，而當模板堿基帶有修飾時，聚合酶會慢下來，使帶有修飾的堿基兩個相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值如果大于1，由此就可以推斷這個位置有修飾。通過聚合酶動力學提供的信息，可直接檢測到DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，為表觀遺傳學研究打開了一條通路。
3. 突變鑒定 (SNP檢測)
單分子測序的分辨率具有不可比擬的優勢，而且沒有PCR擴增步驟，就沒有擴增引入的堿基錯誤，該優勢使其在特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定中大顯身手。
2. 甲基化研究
SMRT技術采用的是對DNA聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法，聚合酶合成每一個堿基，都有一個時間段，而當模板堿基帶有修飾時，聚合酶會慢下來，使帶有修飾的堿基兩個相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值如果大于1，由此就可以推斷這個位置有修飾。通過聚合酶動力學提供的信息，可直接檢測到DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，為表觀遺傳學研究打開了一條通路。
3. 突變鑒定 (SNP檢測)
單分子測序的分辨率具有不可比擬的優勢，而且沒有PCR擴增步驟，就沒有擴增引入的堿基錯誤，該優勢使其在特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定中大顯身手。
圖4 用三代測序技術研究細菌基因組和甲基化組
